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a Department of Anatomy, b Institute of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, National Yang-Ming University, Taipei, c Department of Physiology, Chinese Medical College, Taichung, Taiwan, ROC
Key Words
Human umbilical mesenchymal cell W - Stem cell - Neuronal differentiation - Neuron - Astrocyte - Microglia
Abstract
Neuronal transplantation has provided a promising approach for treating neurodegenerative diseases. Recently, efforts have been directed at in vitro induction of various stem cells to transform into neurons. We report the first successful quantities in an in vitro attempt at directing the transformation into neurons of human umbilical mesenchymal cells, which are capable of rapid proliferation in vitro and are easily available. When cultured in neuronal conditioned medium, human umbilical mesenchymal cells started to express neuron-specific proteins such as NeuN and neurofilament (NF) on the 3rd day and exhibited retraction of the cell body, elaboration of processes, clustering of cells and expression of functional mRNA responsible for the synthesis of subunits of the kainate receptor and glutamate decarboxylase on the 6th day. Between the 9th and 12th days, the percentage of human umbilical mesenchymal cells expressing NF was as high as 87%, while functionality was demonstrated by glutamate invoking an inward current. At this stage, cells were differentiated into mature neurons in the postmitosis phase.
Introduction
In clinical medicine, stroke, trauma or degenerative neuronal diseases are mainly due to the ineffective prevention of neuronal death. The degeneration or death of neurons may lead to varying degrees of deficits in neuronal functions, affecting various central nervous system (CNS)-mediated functions and compromising the general quality of life. Recent findings indicate that stem cells exist in the CNS [4, 12, 14, 15]. Under normal circumstances or when neurons are damaged, these neuronal stem cells may be stimulated to proliferate and differentiate, albeit at a relatively slow rate.
Stem cells, believed to possess certain characteristics including self-renewal, pluripotency, proliferation, longevity and differentiation, can be a valuable source for neuronal transplantation. Fetuses [5, 16], umbilical cord blood [6] and bone marrow [11] are the most common sources of human stem cells. The use of fetal tissues is controversial due to ethical and religious issues. Alternative sources of stem cells are therefore desirable. As the in vitro conversion rate of umbilical cord blood into neurons is relatively low [9, 21], research into and application of umbilical cord blood have been confined mainly to hematological diseases. Bone marrow mesenchymal stem cells are capable of differentiating into osteogenic, chondrogenic, adipogenic and myogenic cells in vitro [11]. Direct transplantation of bone marrow mesenchymal cells, however, results in a relatively low percentage of cells differentiating into neurons, with the majority differentiating into Transformation of Human Umbilical Mesenchymal Cells into Neurons J Biomed Sci 2004;11:652–660 653 glia [2, 13], and thus they cannot adequately rescue deficits due to neurological diseases. Other studies have raised the possibility that such mature cells could result from fusion of bone marrow stem cells with mature resident tissue cells [27, 30]. Therefore, transplantation of postmitotic neurons derived from stem cells has become an attractive option in the treatment of neurological diseases.
In the present study, we showed that culturing human umbilical mesenchymal cells in neuronal conditioned medium (NCM) encourages and facilitates their transformation into neurons quickly and with good yield. As human umbilical mesenchymal tissues are readily available and the cells easily prepared, they may provide a ready source of transplantation cells for clinical applications.
Methods
Preparation of Human Umbilical Mesenchymal Cells
Human umbilical cords were collected in HBSS (Gibco 14185- 052, USA) at 4° C. Following disinfection in 75% ethanol for 30 s, the umbilical cord vessels were cleared off in HBSS. The mesenchymal tissue (in Wharton’s jelly) was diced into cubes of about 0.5 cm3 and centrifuged at 250 g for 5 min. Following removal of the supernatant fraction, the precipitate (mesenchymal tissue) was washed with serum-free DMEM (Gibco 12100-046) and centrifuged at 250 g for 5 min. The mesenchymal tissue was treated with collagenase at 37°C for 18 h, washed and further digested with 2.5% trypsin (Gibco 15090-046) at 37°C for 30 min. Fetal bovine serum (FBS; Hyclone SH30071.03, USA) was added to the mesenchymal tissue to neutralize the excess trypsin. The dissociated mesenchymal cells were further dispersed by treatment with 10% FBS-DMEM and counted. The mesenchymal cells were then used directly for cultures or stored in liquid nitrogen for later use.
Neuronal Induction and NCM
Seven-day postnatal Sprague-Dawley rats were anesthetized by intraperitoneal injection of 10% chloride hydrate. The brain was removed, placed in Ca2+-Mg2+-free buffer (Gibco 14185-052) and centrifuged at 900 rpm for 5 min. Following removal of the supernatant fraction, 10% FBS-DMEM was added to the precipitate (brain tissue). The brain tissue suspension was triturated 15 times for dispersal into single cells. The cells were suspended in 10% FBS-DMEM and incubated at 37°C in 5% CO2 and 95% O2. The next day, AraC at a concentration of 2 ÌM (Sigma c-6645, USA) was added. On the 5th day of culture, the culture medium was removed (NCM) to be used for the culture of umbilical mesenchymal cells. The human umbilical mesenchymal cells were cultured in NCM alone, which was replaced every other day.
Immunocytochemistry
Human umbilical mesenchymal cells were fixed with 4% paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer for 20 min, and washed with 0.1 M phosphate buffer. They were then treated with blocking solution (0.05% Triton X-100, 5% normal goat serum and 3% bovine serum albumin) for 30 min in order to prevent nonspecific antibodyantigen binding. The cells were then reacted with primary antibodies [anti-NeuN 1:100 from Chemicon MAB377, anti-neurofilament (NF)200 1:250 from Chemicon AB1982, anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) 1:1,000 from Chemicon AB5804, anti-OX42 1:200 from Serotec MCA275G, anti-parvalbumin 1:40 from Santa Cruz sc-7449 and anti-calbindin 1:40 from Santa Cruz sc-7691] at 4°C for 18 h, washed with 0.1 M PBS, reacted with secondary antibodies at room temperature for 1 h, washed again with 0.1 M PBS, reacted with ABC complex (ABC KIT, Vectorlabs PK-4000) at room temperature for 1 h, washed with 0.1 M PBS, and finally developed with 3,3)-diaminobenzidine (DAB) (5 mg of DAB, 3.5 Ìl of 30% H2O2 in 10 ml of 50 mM Tris buffer).
Western Blotting for GAD, GluR5, GluR6, GluR7 and KA2
Cell membrane was prepared from umbilical mesenchymal cells cultured in NCM for varying periods. Following resolution on 20% SDS-PAGE, the cell proteins were blotted onto a PVDF paper which was then washed with TBS solution, immersed in the blocking solution for 60 min, washed with TBS buffer again and reacted with primary antibodies (anti-glutamate decarboxylase 1:1,500 from Chemicon AB108, anti-KA2 1:1,800 from UPSTATE 06-315, anti-GluR5 1:30 from Santa Cruz sc-7617, anti-GluR6 1:30 from Santa Cruz sc-7618, and anti-GluR7 1:30 from Santa Cruz sc-7620) at 4°C for 12–18 h. After the reaction was completed, the PVDF paper was washed with TTBS, immersed in the blocking solution for 60 min and then reacted with secondary antibodies at room temperature for 1 h. The PVDF paper containing the reaction products was washed with TTBS, reacted with ABC complex (Vectorlabs PK-4000) at room temperature for 1 h, washed again with TTBS and finally developed with DAB.
Reverse Transcription-PCR
On day 0 (no NCM treatment) and day 12 after NCM treatment, total RNA from human umbilical mesenchymal cells was isolated using Trizol reagent (BD Biosciences Clontech, USA). Reverse transcription was performed using random primers and Superscript (BD Biosciences Clontech). PCR was performed by mixing PCR Supermix (BD Biosciences Clontech) with 2 Ìl of cDNA of various dilutions with a 0.2 ÌM concentration of each gene-specific primer in a final volume of 30 Ìl. Samples were subjected to 30 heat cycles of 94, 55 and 72° C of 30 s duration. PCR products were run on a 2% agarose gel and visualized using ethidium bromide staining. The primers used were 5)-ttctacccgaacccaggagccgaa-3) (sense) and 5)-tgcaccaggtctaaaatggcacggc- 3) (antisense) for human GluR6, 5)-caaggctgagtgcctgctgcgattg- 3) (sense) and 5)-cgcccggtcagcccatcatactcta-3) (antisense) for human KA2, and 5)-gctgacatcaacggccaata-3) (sense) and 5)- gcggtgcttcctggacatga-3) (antisense) for human GAD.
BrdU and 4),6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrocholoride
Double Staining
The human umbilical mesenchymal cells were cultured in NCM for 3 or 9 days. In the final 24 h, they were treated with BrdU (Sigma B-5002; final concentration 50 ÌM). Then, the cells were washed with 0.1 M PBS, fixed with 70% ethanol in 50 mM glycine buffer, pH 2.0, at –20°C for 30 min, washed with 0.1 M PBS and treated with the blocking solution (0.05% Triton X-100, 5% normal goat serum and 3% bovine serum albumin). The treated cells were then reacted with primary antibodies (anti-BrdU 1:100 from Chemicon MAB3222, diluted with 0.66 mM CaCl2 and 1 mM ß-mercaptoethanol in 66 mM Tris buffer) at 4 ° C for 36 h, washed with 0.1 M PBS, 654 J Biomed Sci 2004;11:652–660 Fu/Shih/Cheng/Min Fig. 1. Photomicrographs showing the change in morphological pattern and the expression of neuron-specific proteins NeuN and NF of human umbilical mesenchymal cells treated with NCM. A, B Umbilical mesenchymal cells treated with 10% FBS-DMEM for 3 days (A) and 6 days (B). C Cells treated with NCM for 3 days. D Cells treated with NCM for 12 days. E–L Umbilical mesenchymal-derived cells expressed the neuron-specific proteins NeuN (E) and NF (F) after NCM treatment for 6 days. NeuN-positive cells with bipolar (G), multipolar (H) or mesenchymal-like (I) shapes are shown. The morphology of NF-positive cells could be bipolar (J), multipolar (K) or mesenchymal (L). Arrows indicate positively stained cells; arrowheads indicate negatively stained cells. Scale bar: 50 Ìm in A, B, E–L; 100 Ìm in C–D. reacted with secondary antibodies (fluorescein-conjugated goat antimouse IgG, diluted 1:50; Chemicon AP124F) and 1 mg/ml 4),6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholoride (DAPI; Sigma D9542) at room temperature for 1 h, and washed again with 0.1 M PBS. The cells were observed under a fluorescence microscope.
BrdU and Anti-NF Double Staining
Immunostaining for NF and BrdU labeling were employed to respectively confirm and identify neurons and the replication of cells. NF and BrdU double labeling identify the replication capability of neurons.
Electrophysiology
For experimentation, a glass slide containing human umbilical mesenchymal cells was transferred to an immersion-type recording chamber and superfused with artificial cerebrospinal fluid (119 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 26.2 mM NaHCO3, 1.3 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 11 mM glucose, 5% CO2, 95% O2). The bath solution was perfused at a rate of 15 ml/min. All signals were filtered at 2 kHz by a low-pass Bessel filter provided by the amplifier (Axopatch-1D; Axon Instruments, Foster City, Calif., USA) and digitized at 5 kHz using CED micro 1401 interface running Signal software (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK).
Statistical Analysis
All data were presented as mean B SEM. One-way ANOVA was used to compare all means, and last significant difference (LSD) was used for the a posteriori test. In all statistical analyses, p ! 0.05 was considered significant.
Results
Morphological Identification
About 106 human umbilical mesenchymal cells were collected from 20 cm of umbilical cord. The number of umbilical mesenchymal cells doubled (2 ! 106) in 10% FBS-DMEM in 3 days. The umbilical mesenchymal cells so prepared could be used directly for induction into neurons or stored in liquid nitrogen for later use. The umbilical mesenchymal cells exhibited a mesenchymal-like shape with a flat and polygonal morphology following treatment with 10% FBS-DMEM for 3 days (fig.1A). With continuous culture for 6 days, the mesenchymal cells appeared mostly spindle-shaped and were closely apposed to each other due to proliferation (fig.1B). Treatment with NCM caused umbilical mesenchymal cells to display a neuronal-like morphology. These cells had a smaller cell body and displayed neurite- and axon-like processes after being cultured in NCM for 3 days (fig.1C). Prolonging the NCM treatment resulted in cell clustering and process elongation. After 12 days, these processes were exceedingly long and had formed cell-cell contacts and created the appearance of a network (fig.1D).
Time Course of Neuronal-Like and Glial-Like
Differentiation
To determine whether human umbilical mesenchymal-derived cells could express neuronal markers, we applied immunocytochemical staining for NeuN and NF. On the 6th day after NCM treatment, umbilical mesenchymal cells presented the characteristic of clustering and expressed NeuN (fig.1E) and NF (fig.1F). Morphology patterns of cells expressing NeuN included bipolar, multipolar and mesenchymal-like shapes (fig.1G–I). A 3-day NCM treatment induced 42.2 B 5.0% of umbilical mesenchymal cells to stain positively for the neuronal marker NeuN. The proportion of cells expressing NeuN reached the maximum of 58.2 B 4.2% on the 9th day but dropped to 36.3 B 5.9% on the 12th day (fig. 2A). After treatment with NCM, umbilical mesenchymal cells expressing NF displayed bipolar, multipolar or mesenchymal-like shapes (fig. 1J–L). After 3 days of treatment, 59.4 B 1.3% of the cells displayed robust immunostaining for NF. The proportion of NF-positive cells further increased to 87.4 B 5.5% and reached a plateau on the 6th day that persisted up to 12 days after treatment (fig.2B).
In order to assess the relative proportions of astrocytes and microglia in the cell population, immunocytochemical staining for GFAP and OX42 (CD11b) was performed. Prior to NCM treatment, 0.64% of human umbilical mesenchymal cells expressed GFAP. Treatment with NCM for 3 days caused 1.3% of umbilical mesenchymal cells to display GFAP. This percentage reached a maximum on the 9th day but declined back to 1.95% on the 12th day (fig. 2C). Expression of OX42 was seen in 1.77 B 0.63% of untreated umbilical mesenchymal cells. Treatment with NCM for 3 days caused more microglia differentiation (3.00 B 0.26%), and this percentage remained consistent and persisted up to 12 days (fig.2D).
Characterization of Functional Protein In order to verify the expression of functional neuronal protein in human umbilical mesenchymal cells, the presence of subunits of kainate receptor were determined by Western blotting. As the results showed, subunits of kainite receptor were not detected in human umbilical mesenchymal cells before treatment with NCM. The kainite receptor subunits, including GluR6, GluR7 and KA2, began to appear in small quantities in the umbilical mesenchymal cells following treatment with NCM for 6 days, with the labeling becoming significant after 12 days (fig.3A). In order to eliminate the possibility that the NCM contained glutamate receptor and GAD, RT-PCR experiments for GluR6, KA2 and GAD were performed. The results showed that the mRNAs of GluR6, KA2 and GAD were found in the human umbilical mesenchymal cells on the 12th day of NCM treatment, whereas they were not detectable prior to NCM treatment (fig.3B). In order to confirm the functionality of the glutamate receptor, a whole cell record was made in the neuronallike human umbilical mesenchymal cells after they were cultured with NCM for 12 days (fig.3F). Bath application of 1 mM glutamate evoked an inward current with a magnitude of 50.5 B 1.6 pA (n = 5, 1 cell had no response), with membrane voltage held at –70 mV. The effect of glutamate was completely washed out in a few minutes after the perfusion medium was changed to normal Ringer’s solution (fig.3E). Taken together, the electrophysiological results are consistent with the results of Western blotting and RT-PCR, suggesting that the human umbilical mesenchymal cells did express functional glutamate receptor on the membrane following culture with NCM. Further experiments were carried out to identify the existence of calcium-binding proteins. Among the various calcium-binding proteins found in the nervous system, parvalbumin, calbindin-D28K and calretinin are the most widely distributed in the CNS [10]. Treatment with NCM for 9 days induced some of the human umbilical mesenchymal cells to express several functional calciumbinding proteins, including parvalbumin and calbindin (fig.3C, D). In order to verify the capability of human umbilical mesenchymal cells to synthesize the neurotransmitter GABA, immunostaining for GAD was employed. After a 6-day NCM incubation, human umbilical mesenchymal cells were induced to synthesize GAD, and the GAD expression level was significantly increased on the 12th day (fig.3A).
Change in Cell Proliferation
Although treatment with NCM could induce human umbilical mesenchymal cells to express neuron-specific proteins and functional proteins, whether these cells were capable of proliferating was still unclear. Therefore, a proliferation assay was conducted. DAPI, a DNA-binding fluorescent probe, is able to freely penetrate cellular membranes and is used to count total cell numbers. In order to count the cell number exactly, the human umbilical mesenchymal cells were cultured at a lower density (103/ml). After NCM treatment, the cell density on the 9th day was significantly higher than that on days 0 and 3, and consistent with that on the 12th day (fig.4A, B). Double staining with BrdU and DAPI showed that most of the umbilical mesenchymal cells were still able to proliferate in NCM
for 3 days (fig. 5A–C). Moreover, cells expressing NF were labeled by BrdU simultaneously (fig.5D–F). On the 9th day of treatment with NCM, cell proliferation was not observed in the majority of cells (fig.5G–I). Furthermore, these BrdU-negative cells were neuronal-like cells expressing NF (fig.5J–L).
Discussion
Neuronal Differentiation
In the present study, we successfully utilized human umbilical mesenchymal cells as stem cells. Similar findings have been reported by Mitchell et al. [17]. The human umbilical mesenchymal cells were collected in Wharton’s jelly. With NCM treatment, 87% of these cells could be induced to differentiate into neurons. Numerous studies have indicated that various growth factors, such as retinoic acid, bFGF, BDNF, glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), TGF-ß, insulin-like growth factor and EGF, are involved in the transformation of stem cells into neurons [1, 7, 23, 25, 26]. In addition, neurotransmitters are able to regulate the proliferation, growth, migration, differentiation and survival of neural precursor cells [18]. Moreover, umbilical mesenchymal cells cultured in 10% FBS-DMEM with AraC yielded no significant neurogenesis.We therefore speculate that NCM may contain some cytokines and neurotransmitters released from cultured neurons, which may help to induce stem cells to differentiate into neurons.
In the study of Woodbury et al. [29], treatment with 1–10 mM ß-mercaptoethanol for 5 h induced 75% of bone marrow mesenchymal cells to transform into neurons. However, the use of ß-mercaptoethanol can exert a toxic effect on organisms by breaking up the disulfide bonds [28]. On the other hand, ß-mercaptoethanol exerts a positive effect by increasing the survival rate of neurons in vitro [19]. We attempted to treat umbilical mesenchymal stem cells with 2–5 mM ß-mercaptoethanol for 3 days and observed cell damage (data not
shown). We suggest differences in tolerance may occur because the mesenchymal stem cells are isolated from different adults. The use of ß-mercaptoethanol was not considered in our present study. We found that NeuN and NF were expressed in untreated umbilical mesenchymal stem cells from the
results of immunocytochemical staining. While this result was somewhat surprising, it is consistent with results from Mitchell et al. [17]. Similar results have been observed in bone marrow stromal cells [20, 29]. Woodbury et al. [29]
also found that neuron specific enolase (NSE) was expressed in untreated bone marrow stromal cells. In other work with bone marrow stromal cells, Sanchez-Ramos et al. [20] found that NeuN and GFAP, markers for early mature neurons and astrocytes, respectively, were expressed in uninduced bone marrow stromal cells. Likewise, we found that the glial cell markers GFAP and OX42 were expressed in untreated umbilical mesenchymal cells. Our results, along with the studies described above, suggest that untreated umbilical mesenchymal stem cells express a low number of neural and glial proteins spontaneously and, perhaps, are primed to differentiate along a neural program.
In our study, the proportion of cells expressing NeuN reached a maximum on the 9th day and declined on the 12th day. The drop in the number of NeuN-positive cells on the 12th day could be due to the absence of NeuN expression in some mature neurons. It has previously been reported that neurons start to express NeuN in the early phase during development and that the expression of NeuN by neurons in some brain areas may be decreased after maturation [22]. Numerous calcium-binding proteins have been found in the CNS in various types of neurons. Research has indicated that both parvalbumin and calbindin are expressed in approximately 5–10% of neurons. Moreover, the expression of parvalbumin is confined to GABAergic neurons [24]. Therefore, parvalbumin and calbindin were only expressed on some of the neurons derived from umbilical mesenchymal cells in our experiments. Our study showed that NF-positive neurons still possessed the capability to proliferate following a 3-day treatment, but lost this capability after 9 days. What causes the loss warrants further investigation.
Glial Differentiation
In the present study, less than 5% of umbilical mesenchymal cells differentiated into astrocytes. However, we feel that they may still be important in exerting a positive regulatory effect on the differentiation and maturation of neurons. Several studies have confirmed that astrocytes secrete certain growth factors that affect the maturation of neurons. For example, the secretion of GDNF was able to effectively alleviate the damage of dopaminergic neurons [8]. In addition, tumor necrosis factor-• has also been shown to be secreted by astrocytes to regulate the formation of synapses on neurons and control the sensitivity of these synapses [3].
Concluding from our results, it is believed that the most suitable time point for harvesting cultured human umbilical mesenchymal cells for transplantation is between the 6th and 9th days of NCM treatment, since at this stage, neurons have the lowest capability for proliferation and the highest percentage of neurons expressing NeuN and NF. In addition, a small quantity of astrocytes and microglia exist, which may promote neuronal survival and remodeling after transplantation. After being transplanted into individuals with neurological diseases, these neuronal-like cells derived from human umbilical mesenchymal
cells can be expected to be able to make up for the functional deficit created by damaged neurons.
Translation - Spanish Transformación in vitro de células mesenquimáticas del cordón umbilical humano en neuronas
a Departamento de Anatomía , b Instituto de Anatomía y Biología Celular, Escuela de Medicina, Universidad Nacional Yang-Ming, Taipei, c Departamento de Fisiología, Colegio Médico Chino, Taichung, Taiwán, ROC
Resumen
El transplante de neuronas ha provisto un enfoque promisorio para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas. Se han hecho esfuerzos recientes dirigidos a la inducción in vitro de varias células madre para transformarse en neuronas. Informamos que ya están disponibles las primeras cantidades logradas de un intento in vitro de transformación de células mesenquimáticas del cordón umbilical humano en neuronas, las cuales son capaces de una rápida proliferación. Cuando las células mesenquimáticas del cordón umbilical humano se cultivan en un medio condicionado con neuronas, comienzan a producir, en el tercer día, proteínas específicas para neuronas, tales como NeuN y neurofilamento (NF) y exhiben retracción del cuerpo celular, elaboración de procesos, aglutinamiento de células y expresión del ARN mensajero funcional responsable por la síntesis de subunidades del receptor kainate y de decarboxilasa de glutamato en el sexto día. Entre el día noveno y el duodécimo, el porcentaje de células mesenquimáticas del cordón umbilical humano que producían NF era del 87%, mientras que la funcionalidad se demostró porque el glutamato invoca una corriente interna. En está etapa, las células se diferenciaron en neuronas maduras en la fase de post mitosis.
Introducción
En medicina clínica, la apoplejía, el trauma o las enfermedades neurodegenerativas se debe principalmente a la ineficiencia del organismo para prevenir la muerte neuronal. La degeneración o la muerte de las neuronas pueden causar varios grados de deficiencia en las funciones neuronales y esto afecta varias funciones mediadas por el sistema nervioso central y compromete la calidad de vida en general. Los hallazgos recientes indican que existen células madre en el sistema nervioso central [4, 12, 14, 15]. Bajo circunstancias normales o cuando se dañan las neuronas, estas células madre neuronales se pueden estimular para que proliferen y se diferencien aunque a un ritmo relativamente bajo.
Las células madre, que se cree poseen ciertas características incluyendo la auto renovación, la pluripotencialidad, la proliferación, la longevidad y la diferenciación, pueden ser un recurso valioso para los trasplantes de neuronas. Los fetos [5, 16], la sangre del cordón umbilical [6] y la médula ósea [11] son las fuentes más comunes de células madre humanas. La utilización de tejidos fetales causa controversia debido a asuntos morales y religiosos. Por consiguiente se desea encontrar otras fuentes de células madre. Como la velocidad a la que las células madre provenientes de la sangre del cordón umbilical es relativamente baja [9, 21], las investigaciones y la práctica sobre células madre provenientes de la sangre del cordón umbilical se han limitado principalmente a enfermedades hematológicas. Las células madre mesenquimáticas provenientes de la médula ósea son capaces de diferenciarse, in vitro, en células osteogénicas, condriogénicas, adipogénicas, y miogénicas [11]. Sin embargo, el trasplante directo de células mesenquimáticas de la médula ósea tiene como resultado un porcentaje relativamente bajo de células que se diferencian en neuronas. La mayoría de ellas se diferencian en células gliales [2, 13] y entonces, no pueden suplir adecuadamente deficiencias debidas a enfermedades neurológicas. Otros estudios han elevado la posibilidad de que esas células maduras puedan resultar de la fusión de células madre de la médula ósea con células maduras de tejidos resistentes [27, 30]. Por consiguiente, el trasplante de neuronas en fase post-mitótica derivadas de las células madre se ha convertido en una opción más aceptable en el tratamiento de enfermedades neurológicas.
En el estudio actual, demostramos que cultivar células mesenquimáticas del cordón umbilical humano en un medio condicionado con neuronas (MCN), estimula y facilita su trasformación rápida en neuronas con buena producción. Como los tejidos mesenquimáticos del cordón umbilical están disponibles libremente y las células se preparan fácilmente, ellos pueden proveer una fuente lista de células para trasplante y para aplicaciones clínicas.
Métodos
Preparación de células mesenquimales del cordón umbilical humano
Los cordones umbilicales humanos se recogieron en HBSS (Gibeo 14185-052, USA) a una temperatura de 4º C. Después de la desinfección en una solución de 75% etanol por 30 seg., se separaron los vasos sanguíneos del cordón umbilical en HBSS. El tejido mesenquimático (preparado en solución gelatinosa Wharton) se picó en cubos de 0.5 cms3 y se centrifugó a 250 g por 5 minutos. Después de remover la fracción superficial de la preparación, el tejido mesenquimático presipitado se lavó con DMEM (Gibco 12100-046) libre de suero y se centrifugó a 250 g por 5 minutos. El tejido mesenquimático se trató con colagenasa a 37º C. por 18 horas, se lavó y se digirió mas con 2.5% de tripsina (Gibco 15090-046) a 37º C. por 30 minutos. Suero fetal bovino (FBS; Hyclone SH30071.03, USA) le fue adicionado al tejido mesenquimático para neutralizar el exceso de tripsina. Las células mesenquimáticas disociadas se dispersaron aún más mediante tratamiento con 10% de FBS-DMEM y contado. Las células mesenquimáticas se utilizaron, entonces, directamente en cultivos o se almacenaron en nitrógeno líquido para uso posterior.
Inducción Neuronal y NCM
Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley de 7 días de nacidas mediante inyección intraperitoneal de 10% hidrato clorídico. Se extrajo el cerebro, se colocó en una emulsión libre de Ca2+-Mg2+ (Gibco 14185-052) y se centrifugó a 900 rpm por 5 minutos. Luego de extirpar la fracción suprematant, se añadió una solución de 10% FBS-DMEM al tejido cerebral. La suspensión de tejido cerebral se trituró 15 veces para que se dispersaran las células. Se suspendieron las células en una solución de 10% FBS-DMEM y se incubaron a 37º C. en una solución de 5% de CO2 y 95% de O2. Al día siguiente se añadió AraC a una concentración de 2μM (Sigma c-6645, USA). Al quinto día de cultivo, se extrajo el medio de cultivo (NCM) para utilizarse en el cultivo de células mesenquimáticas del cordón umbilical. Se cultivaron células mesenquimáticas del cordón umbilical humano en un medio de sólo NCM que se remplazaba cada tercer día.
Inmuno-cito-química
Se fijaron células mesenquimáticas del cordón umbilical humano, con una solución de 4% de paraformaldehido, en una suspensión de 0.1 M de fosfato por 20 minutos y esta se lavó con 0.1 M emulsión de fosfato. Después, se trataron estas células con una solución bloqueadora (0.05% Tritón X-100, 5% suero de cabra normal y 3% albúmina de suero bovino) por 30 minutos para prevenir la unión de anticuerpos y antígenos. Las células se hicieron reaccionar con anticuerpos primarios [anti-NeuN 1:100 de Chemicon MAB377, anti-neurofilamento (NF)200 1:250 de Chemicon AB1982, proteína acídica fibrilar anti-glial (GFAP) 1:1,000 de Chemicon AB5804, anti-OX42 1:200 de Serotec MCA275G, anti-paravalbumina 1:40 de Santa Cruz sc-7449 y anti-calbindina 1:40 de Santa Cruz sc-7691] a 4º C por 18 horas. Este cultivo de células se lavó con 0.1 M PBS. Ellas reaccionaron con anticuerpos a temperatura ambiental por 1 hora y se lavó estas células de nuevo con 0.1 M PBS. Ellas reaccionaron con complejo ABC (ABC KIT, Vectorlabs PK-4000) a temperatura ambiental por 1 hora, el cual se lava con 0.1 M PBS, y finalmente se desarrolla con 3,3’- diaminobencidina (DAB) (5mg de DAB, 3.5l de 30% agua en 10 ml de 50mM Tris buffer).
Western Blotting para GAD, GluR5, GluR6, GluR7, y KA2
Se prepararon membranas celulares a partir de células mesenquimáticas del cordón umbilical cultivadas en un medio de NCM por varios períodos. Después de la resolución en 20% SDS-PAGE, se vertió las proteínas de la célula en un papel PVDF lavado con una solución TBS sumergida en la solución bloqueadora por 60 minutos, se lavó estas proteínas con una emulsión TBS y se hicieron reaccionar con antibióticos primarios (decarboxilasa antiglutamato 1:1, 500 de Chemicon AB 108, anti KA2 1:1, 800 de UPSTATE 06-315, anti-GluR5 1:30 de Santa Cruz sc-7617, anti-GluR6 1:30 de Santa Cruz sc-7618 y anti-GluR7 1:30 de Santa Cruz sc-7620) a 4º C por entre 12 y 18 horas. Después de que terminó la reacción, se lavó el papel PVDF con TTBS sumergido en la solución bloqueadora por 60 minutos y después reaccionó con anticuerpos secundarios a temperatura ambiental por 1 hora. El papel PVDF que contiene los productos de la reacción se lavó con TTBS, se hizo reaccionar con el compuesto ABC de Vectorlabs PK-4000 a temperatura ambiental y finalmente se desarrolló con DAB.
Transcripción PCR en reversa
El día 0 (sin tratamiento NCM), y el día 12 después del tratamiento con NCM, se aisló todo el ARN (ácido ribonucleico) de células mesenquimáticas del cordón umbilical humano, utilizando el reactivo Trizol (BD Biosciences Clontech, USA). La transcripción inversa se realizó utilizando genes primarios aleatorios y Superscript (BD Biocsiences Clontech). La transcripción PCR se realizó mezclando PCR Supermix (BD Biosciences Clontech) con 2μl de ADNc de varias soluciones con una concentración de 0.2μM de cada primer específico para cada gen en un volumen final de 30μl. Se sometieron las muestras a tres ciclos de calor de 94, 55 y 72ºC de 30 segundos de duración. Los productos PCR se trataron con una solución gelatinosa de agarosa de 2% y se utilizó un tinte de etidium bromídico para su visualización. Los primarios utilizados fueron 5’ –ttctacccgaacccaggagccgaa-3’ (sense) y 5’-tgcaccaggtctaaatggcacggc-3’ (antisense) para GluR6 humano, 5’-caaggctgagtgcctgctcgattg-3’ (sense) y 5’-cgcccggtcagcccatcatactcta-3’ (antisense) para KA2 humano y 5’-gctgactaacggccaata-3’ y 5’-gcggtgcttcctggacatga-3’ (antisense) para GAD humano.
Doble tinturación con BrdU y 4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole dihydrochloride
Células mesenquimáticas del cordón umbilical humano se cultivaron en NCM por entre 3 y 9 días. Durante las últimas 24 horas, se trataron con BrdU (Sigma B-5002; concentración final 50 μM). Después las células se lavaron con una solución de 0.1M PBS, fijado con etanol al 70% en una emulsión de glicina de 50mM con pH 2.0 a -20ºC por 30 minutos, lavado con 0.1M PBS y tratado con una solución bloqueadora (0.05% de tritón X-100, 5% de suero de cabra normal y 3% de albúmina de suero de bovino). Las células tratadas se hicieron reaccionar con anticuerpos primarios (anti-BrdU 1:100 de Chemicon MAB3222 diluido con 0.66mM de CaCl2 y 1 mM de ß-mercaptoetanol en un buffer de Tris de 66mM) a 4ºC por 36 horas lavado con 0.1 M PBS. Las células se observaron bajo un microscopio fluorescente.
Tinturación doble con BrdU y Anti-NF
Se empleó inmunotinturación para marcar NF y BrdU para confirmar e identificar neuronas y la replicación de las células respectivamente. La doble marcación de NF y de BrdU identifica la capacidad de replicación de las neuronas.
Electrofisiología
Para efectos de la investigación, se transfirió una placa de microscopio que contenía células mesenquimáticas del cordón umbilical humano a una cámara de grabación tipo inmersión y se fusionaron con fluido encefalorraquideo artificial (119mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1mM NaH2PO4, 26.2 mM NaHCO3, 1.3mM MgSO4, 2.5 mMCaCl2, 11mM glucosa, 5% CO2, 95% O2). Se perfusionó la solución a una velocidad de 15ml/min. Se filtraron todas las señales a 2 kHz mediante un filtro Bessel de baja frecuencia que provee el amplificador (Axopatch-lD; Axon Instruments, Foster City, Calif., USA) y digitado a 5 kHz utilizando un programa CED micro 1401 interface que trabaja con el programa Signal (Cambridge Elecronic Design, Cambridge, UK).
Análisis Estadístico
Todos los datos se presentaron como media ± SEM. Se utilizó One-way ANOVA para comparar todas las medias y se utilizó la diferencia menos significante (LSD) para una prueba posterior. En todos los análisis estadísticos, p< 0.05 se consideró significante.
Resultados
Identificación morfológica
Cerca de 106 millones de células mesenquimáticas del cordón umbilical humano se colectaron de 20 cms de cordón umbilical. El número de células mesenquimáticas se duplicaron en un medio de FBS-DMEM de 10% en 3 días. Las células mesenquimáticass preparadas de esta manera podrían utilizarse directamente en la inducción a neuronas o almacenarse en nitrógeno líquido para utilizarse más tarde. Después de 3 días de tratamiento con 10% FBS-DMEM, estas células mesenquimáticas mostraron una apariencia de células mesenquimáticas normales con forma plana y poligonal (fig.1A). Con 6 días de cultivo continuo, las células mesenquimáticas tienen en gran parte una apariencia de huso y están muy juntas unas con otras debido a la proliferación (fig. 1B). El tratamiento con NCM causa que las células mesenquimáticas umbilicales muestren una forma parecida a las neuronas. Estas células tienen un cuerpo celular más pequeño y después de ser cultivadas en un medio de NCM por 3 días, muestran procesos similares al de los axones y al de las neuronas (fig. 1C). La prolongación del tratamiento con NCM causa que las células se apeñusquen y se prolonguen. Después de 12 días, estos procesos se prolongaron demasiado y formaron contactos de célula con célula dando la apariencia de una red (fig. 1D).
Cronología de la diferenciación a neuronas y a células gliales
Diferenciacìón
Para determinar si las células derivadas de células mesenquimáticas del cordón umbilical humano podían expresar características neuronales, aplicamos un tinte inmunocitoquímico para NeuN y para NF. Al sexto día, después del tratamiento con NCM, las células mesenquimáticas umbilicales presentaron la característica de aglomerado y expresaron NeuN (fig. 1E) y NF (fig. 1F). Los patrones morfológicos de las células que expresan NeuN incluían formas bipolares, multipolares y mesenquimáticas (fig. 1G-I). Un tratamiento de 3 días con NCM indujo a 42.2 ± 5.0% de las células mesenquimáticas umbilicales a que dieran positivo en la prueba de tinte que muestra el marcador neuronal NeuN. La proporción de células que expresan NeuN alcanzó el máximo de 58.2 ± 4.2% en el noveno día, pero disminuyó a 36.3 ± 5.9% en el duodécimo día (fig. 2A). Después del tratamiento con NCM, las células mesenquimáticas umbilicales que expresaban NF, mostraron formas bipolares, multipolares y mesenquimáticas (fig. 1J-L). Después de 3 días de tratamiento, 59.4 ± 1.3% de las células mostraron una marcación inmunológica fuerte para NF. La proporción de células que dieron positivo para NF aumentaron aún más a 87.4 ± 5.5% y alcanzaron un punto máximo al sexto día que persistió hasta por 12 días después del tratamiento (fig. 2B).
Para saber la proporción relativa de astrocitos y células microgliales en la población total de células, se aplicó una tintura inmuno-cito-química para GFAP y para OX42 (CD 11b). Antes del tratamiento con NCM, el 0.64% de las células mesenquimáticas del cordón umbilical humano expresaban GFAP. El tratamiento con NCM por 3 días causó que el 1.3% de las células mesenquimáticas umbilicales mostraran GFAP. Este porcentaje alcanzó un valor máximo al noveno día, pero disminuyó a 1.95% al duodécimo día (fig. 2C). La expresión de OX42 se observó en 1.77 ± 0.63% de las células mesenquimáticas umbilicales que no recibieron tratamiento. El tratamiento por 3 días con NCM causó más diferenciación de células microgliales (3.00 ± 0.26%) y este porcentaje permaneció constante y persistió hasta 12 días (fig. 2D).
Caracterización de las proteínas funcionales Para verificar la presencia de la proteína neuronal funcional en las células mesenquimáticas del cordón umbilical humano se determinó la presencia de sub unidades del receptor de kainato mediante el método blotting Western. Como demostraron los resultados, las subunidades del receptor de kainato no se detectaron en células del cordón umbilical humano antes del tratamiento con NCM. Las subunidades del receptor de kainato incluyendo GluR6, GluR7 y KA2 comenzaron a aparecer en pequeñas cantidades en las células mesenquimáticas del cordón umbilical después de un tratamiento de 6 días con NCM, siendo más notorio después de 12 días (fig. 3A). Para eliminar la posibilidad de que el NCM contuviera receptores de glutamato y GAD, se llevaron a cabo experimentos RT-PCR para detectar la presencia de GluR6, KA2 y GAD. Los resultados mostraron que se encontró ARNm productor de GluR6, KA2, y GAD en células mesenquimáticas del cordón umbilical humano al 12º día del tratamiento con NCM, mientras que no se detectó antes de dicho tratamiento (fig.3B). Para confirmar la funcionabilidad del receptor de glutamato, se hizo un registro completo de las células mesenquimales del cordón umbilical humano parecidas a neuronas, después de ser cultivadas con NCM por 12 días (fig. 3F). La aplicación de un baño de 1mM de glutamato produjo una corriente interna de 50.0 ± 1.6pA (n = 5, una célula no respondió) con el voltaje de la membrana mantenido en -70mV. El efecto del glutamato se anuló por completo en pocos minutos después de que se cambiara la perfusión del medio por la solución normal del Ringer (fig.3E). Teniendo todo en cuenta, los resultados electrofisiológicos son consistentes con los resultados del método Western blotting y del experimento RT-PCR. Esto sugiere que las células mesenquimáticas del cordón umbilical humano si contienen un receptor funcional del glutamato en la membrana después del cultivo con NCM. Otros experimentos se llevaron a cabo para identificar la presencia de proteínas que fijan el calcio. Entre las distintas proteínas fijadoras del calcio que se encuentran en el sistema nervioso, las más ampliamente distribuidas en el sistema nervioso central CNS [10] son la parvalbumina, calbindina-D28K y la calretina. Un tratamiento con NCM durante 9 días indujo a algunas células mesenquimáticas del cordón umbilical humano a producir muchas proteínas funcionales fijadoras de calcio incluyendo la parvalbumina y calbindina (fig. 3C, D). Para verificar la capacidad de las células mesenquimáticas del cordón umbilical humano para sintetizar neurotransmisores GABA, se empleo un tinteo inmunológico para detectar GAD. Después de una incubación de 6 días con NCM, se indujo a las células mesenquimáticas del cordón umbilical humano a que sintetizaran GAD y el nivel de GAD producido aumentó mucho al 12º día. (fig. 3A).
Cambio en la proliferación celular
Aunque el tratamiento con NCM pudo inducir a las células mesenquimáticas del cordón umbilical humano a que produjeran proteínas específicas de neuronas y proteínas funcionales, todavía no es muy claro que estas células sean capaces de proliferar. Por consiguiente se condujo una prueba de proliferación. DAPI, una prueba de fluorescencia unida al ADN puede penetrar libremente las membranas celulares y se utiliza para contar la cantidad total de células. Para contar la cantidad exacta de células, se cultivaron células mesenquimáticas del cordón umbilical humano a una densidad más baja (103/ml). Después de un tratamiento con NCM, la densidad estaba mucho más alta al noveno día de lo que estaba al inicio y al tercer día y era consistente al duodécimo día (fig. 4ª, B). Un tinteo doble con BrdU y con DAPI mostró que la mayoría de las células mesenquimáticas del cordón umbilical podían todavía proliferar en NCM por 3 días (fig. 5A-C). Además, las células que producían NF se marcaron simultáneamente mediante BrdU (fig. 5D-F). En el noveno día del tratamiento con NCM, no se observó proliferación celular en la mayoría de las células (fig. 5G-I). Más aun, estas células con BrdU negativo eran células como las neuronales que producen NF (fig. 5J-L).
Discusión
Diferenciación neuronal
En este estudio, utilizamos con éxito las células mesenquimáticas del cordón umbilical humano como células madres. Mitchel et al. [17]. han informado sobre hallazgos similares. Las células mesenquimáticas del cordón umbilical humano se coleccionaron en un gel de Wharton. Con un tratamiento de NCM, el 87% de estas células se pudieron inducir a que se diferenciaran en neuronas. Muchos estudios han indicado que varios factores de crecimiento tales como acido retinoico, bFGF, BDNF, el factor neurotrófico derivado de una línea de células gliales (GDNF), TGF-el factor de crecimiento similar a la insulina y el EGF participan en la transformación de células madres en neuronas (1, 7, 23, 25, 26). Además los neurotransmisores pueden regular la proliferación, el crecimiento, la migración, la diferenciación y la supervivencia de las células precursoras neurales (18). Más aun, las células mesenquimáticas del cordón umbilical cultivadas en un medio de 10% de FBS-DMEM con AraC no produjeron una neurogénesis significante. Por consiguiente especulamos que el NCM puede contener algunas citoquinas y neurotransmisores liberados a partir de neuronas cultivadas, lo que ayudaría a inducir a las células madre a que se diferenciaran como neuronas.
En el estudio realizado por Woodbury et al. (29), un tratamiento con 1-1mM ß-mercaptoetanol por 5 horas indujo al 70% de las células mesenquimáticas de la médula osea a que se transformaran en neuronas. Sin embargo, es muy debatible la utilización del compuesto ß-mercaptoetanol. Algunos estudios han indicado que el compuesto ß-mercaptoetanol puede producir un efecto tóxico en organismos al romper los enlaces de sulfato [28]. Por otra parte, el ß-mercaptoetanol produce un efecto positivo al aumentar la tasa de supervivencia en neuronas in vitro (19). Intentamos tratar las células madre mesenquimáticas del cordón umbilical con una solución de 2-5 mM ß-mercaptoetanol por 3 días y observamos un daño celular (los datos no se muestran). Sugerimos que las diferencias en tolerancia pueden ocurrir debido a que las células madre mesenquimáticas son aisladas de diferentes adultos. No se consideró la utilización de ß-mercaptoetanol para este estudio. Encontramos que las células madre mesenquimáticas del cordón umbilical que no recibieron tratamiento produjeron NeuN y NF a partir de los resultados del tinteo inmunocitoquímico. Mientras este resultado era de alguna manera sorprendente, era también consistente con los resultados obtenidos por Mitchel et al. [17]. Se observaron resultados similares en células estromales de la médula osea (20, 29). Woodbury y otros también encontraron que la enolasa específica de neurona también era producida en células estromales de la médula osea que no recibieron tratamiento. Para poder trabajar con células estromales de la médula osea, Sánchez-Ramos y otros encontraron que NeunN y GFAP, marcadores de las primeras neuronas maduras y de los astrocitos, respectivamente, se producian en células estromales de la médula osea no inducidas. De la misma manera, encontramos que los marcadores GFAP y OX42 de las células gliales se producian en las células mesenquimáticas del cordón umbilical no tratadas. Nuestros resultados, junto con los estudios descritos anteriormente, sugieren que las células mesenquimáticas del cordón umbilical que no reciben tratamiento producen espontáneamente una menor cantidad de proteínas de células glíales y de neuronas y que quizás sean las primeras en diferenciarse en un programa neuronal.
En nuestro estudio, la proporción de células que producen NeuN alcanzó un nivel máximo en el noveno día y disminuyó en el duodécimo día. La disminución en la cantidad de células NeuN-positivas podría deberse a la ausencia de producción de NeuN por parte de algunas neuronas maduras. Se ha informado previamente que las neuronas comienzan a producir NeuN en las primeras fases del desarrollo y que la producción de NeuN por parte de las neuronas en algunas áreas del cerebro puede disminuir después de la madurez (22). Varias proteínas fijadoras de calcio se han encontrado en el CNS en varios tipos de neuronas. Las investigaciones han indicado que tanto paravalbumina como calbindina se producen en aproximadamente del 5 al 10% de las neuronas. Además la producción de paravalbumina se concentra en las neuronas GABAergicas (24). Por consiguiente, la parvalbumina y la calbindina se produjeron solamente en algunas de las neuronas derivadas de las células mesenquimáticas del cordón umbilical en nuestros experimentos. Nuestro estudio demostró que las neuronas NF positivas todavía poseían la capacidad de proliferar después de un tratamiento de 3 días, pero que perdían su capacidad después de 9 días. Saber que causa esta pérdida, garantiza que haya más investigación.
Diferenciación de células glíales
En este estudio menos del 5% de las células mesenquimáticas del cordón umbilical se diferenciaron como astrocitos. Sin embargo, sentimos que todavía podrían ser importantes en la producción de un efecto regulador positivo en la diferenciación y maduración de las neuronas. Muchos estudios han confirmado que los astrocitos secretan ciertos factores de crecimiento que afectan la maduración de las neuronas. Por ejemplo, la secreción de GDNF pudo aliviar eficazmente el daño de neuronas productoras de dopamina (8). Además, también se ha mostrado que los astrocitos secretan el factor de necrosis en tumores para regular la formación de sipnasis en neuronas y controlar la sensibilidad de estas sipnasis (3).
Lo que podemos concluir de estos resultados es que se cree que el mejor momento para cosechar células mesenquimáticas del cordón umbilical humano cultivadas para trasplantes es entre el 6º y el 9º días del tratamiento con NCM, ya que en esta etapa las neuronas tienen la menor capacidad de proliferar y un porcentaje más alto de neuronas producen NeuN y NF. Además, existe una pequeña cantidad de astrocitos y de células gliales que puedan promover la supervivencia de las neuronas y la remodelación después del transplante. Después de ser transplantadas a pacientes con enfermedades neurológicas, se puede esperar que estas células similares a neuronas, derivadas de células mesenquimáticas del cordón umbilical humano, puedan suplir el déficit funcional causado por neuronas dañadas.
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This agency was born from the idea of two translators who decided to join forces to provide translation services to companies and persons in specific fields. The members are professionals in the fields of Business Administration, Insurance, Computer Systems and Communication Networks, and Romance Languages.
We combined our educational background and individual working experience to create JERONIMO'S. Each member has more than ten years experience in translation. One member in the field of Insurance and Finances and the other, in the field of Medicine and Science.
We have been working together for more than two years. We started while going to college for our post graduate degree in translation at the University of Valle in Colombia, South America.
Keywords: Linguistic solutions to communication problems in scientific, technological and finantial fields.
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